Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)

Съдържание:

Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)
Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)

Видео: Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)

Видео: Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)
Видео: Эволюция молекулярной диагностики в онкологии 2024, Март
Anonim

Лабораторни резултати: полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция (PCR) е най-важният лабораторен метод за изследване на фината молекулярна структура на генетичния материал. Той се състои от дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК), която изгражда генетичния код на хората, но също и на животните и растенията.

В хуманната медицина PCR се използва за изясняване на наследствените заболявания и генетичните проблеми (риск от заболяване, тест за бащинство и др.), Но също така и при диагностицирането на множество инфекциозни заболявания. За разлика от серологичната диагностика (определяне на антитела срещу патогени в кръвта), PCR методите представляват директен лабораторен метод за медицинско откриване за изясняване на инфекциозни заболявания.

Предимството на PCR е, от една страна, бързата наличност на резултатите от теста. Освен това методите за PCR обикновено са много чувствителни.

навигация

  • продължавай да четеш
  • повече по темата
  • Съвети, изтегляния и инструменти
  • Какво представлява полимеразната верижна реакция (PCR) и какво се изследва?
  • Как работи PCR?
  • Какви резултати от теста предоставя PCR?
  • Има ли допълнителни развития в конвенционалната PCR?
  • Кои са основните области на приложение за PCR?
  • Има ли референтни стойности за резултатите от PCR теста?

Това означава, че дори и най-малките количества генетичен материал на патоген (бактерии, вируси и др.) Водят до надеждно положителен резултат в рамките на периода на откриване на съответния патоген в съответния тестов материал. Предимно кръвта, но също така и други телесни течности (храчки, урина, ликьор и др.) Се използват като материали за изследване на PCR методите.

Какво представлява полимеразната верижна реакция (PCR) и какво се изследва?

Полимеразната верижна реакция („Полимеразна верижна реакция“- PCR) е най-важният лабораторен метод за изследване на фината молекулярна структура на генетичния материал. Поради тази причина този метод на разследване е известен още като

“Молекулярна диагностика”

Основата на генетичния материал (наричан още "генетичен материал") е специална, дълговерижна молекула:

"ДНК" (дезоксирибонуклеинова киселина)

При хората генетичният материал, изграден от двуверижна ДНК (две комплементарни нишки), се намира в ядрото на всички телесни клетки, при което всички телесни клетки на индивида имат идентичен генетичен материал. Освен това точният състав на индивидуалния генетичен състав на всеки човек е уникален - сравним с пръстовия отпечатък, който също е уникален за всеки човек.

По тази причина се нарича и генетичният материал

"Генетичен код" означава, защото чертежът на всички телесни структури на човек е картографиран в тази криптирана форма и запазен по този начин и може да бъде предаден

В клетъчните ядра на клетките на тялото ДНК е в специален ред, известен като

"Хромозоми" (наследствени тела) се нарича. При хората те винаги се срещат по двойки в телесните клетки, като едната се наследява от майката, а другата от бащата. В този смисъл всички телесни клетки на човек съдържат общо 46 хромозоми - 22 двойки така наречените автозоми и една двойка така наречени полови хромозоми

С помощта на лабораторния метод на PCR, от една страна, може да се изследва фината структура на човешката ДНК, което е важно за диагностициране на заболявания или за изясняване на конкретни въпроси:

  • Изясняване на наследствени заболявания,
  • Оценка на риска от заболяване,
  • Изследване на вродените особености на метаболизма,
  • криминалистичен (т.нар. „криминалистичен“) анализ (напр. доказателство за бащинство) и много други

От друга страна, не само, че хората имат съответния генетичен състав, но всъщност всички форми на живот на земята имат специфичен генетичен състав:

  • Животни,
  • Растения,
  • Гъби,
  • Бактерии,
  • Вируси,
  • Паразити и т.н.

Генетичният състав на тези форми на живот също се състои главно от ДНК или, в случай на някои вируси, също и от РНК (рибонуклеинова киселина), която за разлика от ДНК е едноверижна. Следователно в медицинската диагностика PCR се използва и за изясняване на множество инфекциозни заболявания:

  • бактериални инфекции (напр. туберкулоза, бактериални венерически болести),
  • вирусни инфекции (напр. вирусен хепатит, HIV инфекция),
  • паразитни инфекции (напр. малария) и много други

Как работи PCR?

Методът PCR е разработен през 1983 г. от американския биохимик Кари Б. Мулис и по същество се основава на два принципа:

  • Умножение ("амплификация") и на малка част от генетичния материал (ДНК или РНК)
  • Откриване и идентификация на умножените ("амплифицирани") продукти на амплификацията.

Следователно са необходими следните компоненти за извършване на PCR:

  • материал за изпитване (например проби от кръв, клетки или тъкани),
  • някои реагенти ("полимераза", "праймер", "нуклеотиди" [това са градивните елементи на ДНК] и др.) и лабораторно оборудване за амплификация на генетичния материал, както
  • система за откриване на PCR продуктите.

По отношение на реагентите и лабораторното оборудване, необходими за извършване на PCR, следният ензим е в основата на целия процес на PCR:

полимеразата Taq

Това е ензим, който се получава от микроорганизма "Thermus aquarius" (Taq) - бактериален щам, който съществува в близост до горещи вулканични извори и може да оцелее, адаптиран към високите температури на заобикалящата го среда.

Специалността на Taq полимеразата е, че този ензим може да изпълнява своята функция и при високи температури над 50 ° по Целзий (C) -

умножаването ("амплифицирането") на ДНК

В допълнение към Taq полимеразата, преди PCR анализа трябва да бъде точно определено коя част от ДНК трябва да бъде изследвана. За тази цел са ви необходими къси ДНК фрагменти, чиято фина структура съответства на целевата ДНК област по отношение на съответния генетичен код („ДНК последователност). Тези ДНК фрагменти се наричат

„Буквар“наречен

Действителният процес на усилване в контекста на PCR накрая включва следните стъпки:

  • Екстракция на генетичния материал (ДНК или РНК) от тестовия материал.

    Когато се изследва РНК, кодовата последователност на рибонуклеиновата киселина трябва първо да се преобразува в ДНК кодова последователност, което трябва да се направи с ензима "обратна транскриптаза" в аналитичен етап преди действителното усилване

  • Усилване на генетичния материал в няколко стъпки ("цикли"):

    • Първа стъпка - "ДНК денатурация": чрез нагряване (95 ° C) на двуверижната ДНК тя се разтопява на единични вериги.
    • Стъпка втора - „Отгряване“: при по-ниска температура (приблизително 55 ° C) „праймерите“вече могат да се прикрепят към своите ДНК целеви последователности.
    • Стъпка трета - „Удължаване“: при температура 72 ° C ензимът Taq полимераза вече се разширява („удължава“) началната последователност на праймера, използвайки така наречените „нуклеотиди“(това са градивните елементи на ДНК) и го изгражда по този начин нова, удължена ДНК молекула.

Тъй като стъпки от една до две се повтарят в няколко цикъла, се създават все по-дълги новообразувани ДНК вериги, откъдето идва и името на този лабораторен процес „полимеразна верижна реакция“.

  • Анализ на новосъздадените ДНК вериги (така наречените "PCR продукти"):

    В края на верижната реакция (цикли) PCR продуктите - т.е. новосъздадените ДНК молекули - се изследват и оценяват качествено или количествено. Съществуват многобройни възможности за самото това оценяване, най-вече на базата на оцветяване (особено флуоресцентни багрила) на ДНК и я прави видима (посредством гел електрофореза или фотометрично откриване на флуоресценция)

Какви резултати от теста предоставя PCR?

Резултатите от съвременните PCR методи могат да бъдат обобщени в две групи:

  • качествени и
  • количествени резултати.

При качествена PCR се изследва дали определен участък от генетичния материал (ДНК или РНК) присъства в тестовия материал („положителен“резултат) или не („отрицателен“резултат).

Следователно качествената PCR се използва главно за изясняване на следните диагностични въпроси (резултати „да / не“):

  • Диагностика на наследствени заболявания,
  • Изясняване на мутациите,
  • Разпознаване на генетични характеристики (напр. Предразположение към определени заболявания) и др.

Количествената PCR е по-нататъшно развитие на този лабораторен метод, при което се открива не само наличието на определена област от генетичния материал, но и количеството на генетичния материал едновременно. Съответно количествената PCR се използва главно в следните области на медицината:

  • Като част от диагнозата инфекция, количеството патогени в тялото на пациента може да бъде точно определено. В случай на вирусни инфекции, този метод на PCR се използва за лечение на т.нар

    Изследван вирусен товар

В допълнение, количествената PCR също е много важна при фундаменталните изследвания, при което не само хуманната медицина, но и редица други научни области (ветеринарна медицина, биохимия, биология и др.) Се възползват от този процес.

Предимството на PCR при диагностицирането на инфекциозни заболявания е, че резултатите от теста на този лабораторен метод са достъпни изключително бързо (обикновено в рамките на един работен ден). В допълнение, PCR е високочувствителен лабораторен метод. Това означава, че дори и най-малките количества бактерии или вируси в тествания материал водят до надеждно положителен резултат.

Има ли допълнителни развития в конвенционалната PCR?

Специално по-нататъшно развитие на методологията PCR е

Мултиплекс PCR

При мултиплекс PCR се използват едновременно няколко ДНК целеви последователности (прочетени: няколко праймера). Това създава смес от PCR продукти, които трябва да бъдат открити и оценени съответно.

Мултиплексната PCR също се използва предимно в медицината

  • човешката генетика също
  • диагнозата инфекция.

Предимството на този метод е, че като цяло трябва да се получи по-малко тестов материал от пациентите и в една стъпка от анализа може да се създаде серия от тестови резултати. Тези предимства по отношение на диагностиката обаче се компенсират от високата цена за анализ в много случаи.

Друга специалност за използването на PCR е лабораторният процес на

ДНК секвениране

Това е диагностична възможност за дешифриране на точната последователност на генетичния код при пациент. Методът на секвениране може също да се основава на PCR технология.

Тъй като секвенирането е значително по-сложно и скъпо в сравнение с конвенционалните PCR методи, понастоящем то е запазено за специална диагностика (разширен анализ на генома) и научни въпроси.

Кои са основните области на приложение за PCR?

По отношение на областите на приложение на PCR в хуманната медицина, тази лабораторна процедура се използва за следните диагностични въпроси:

  • Изясняване на наследствените заболявания - вече съществуват PCR методи за повече от 600 различни наследствени заболявания.
  • Фармакогенетика - чрез изучаване на генетичните характеристики на чернодробния метаболизъм могат да се направят изводи за ефективността и дозировката на лекарствата.
  • Туморна медицина („онкология“) - тук, от една страна, PCR се използва за изясняване на рисковите фактори за някои туморни заболявания (например рак на гърдата). От друга страна, клетките и тъканите в вече възникнали тумори също могат да бъдат изследвани по отношение на различни мутации, което играе все по-важна роля в лечението на тези заболявания.
  • Съдебна медицина ("криминалистика") - тук PCR е от голямо значение, например, в производства по бащинство и в криминологията ("ДНК пръстови отпечатъци").
  • Инфекциозно лекарство - PCR има незаменима стойност при диагностицирането, прогресирането и контрола на терапията на бактериални, вирусни и паразитни инфекциозни заболявания.

За повече информация относно рака вижте Рак.

Има ли референтни стойности за резултатите от PCR теста?

По отношение на референтните стойности в методите на PCR, винаги трябва да се взема предвид съответният диагностичен въпрос. Тъй като някои генетични характеристики се откриват като част от изследване за наследствени заболявания (напр. Анализ на мутация), в такива лабораторни анализи няма референтна стойност („положителна“или „отрицателна“), както няма референтна стойност за цвета на косата например. Тъй като цветът на косата също е генетична характеристика.

В допълнение, лабораторните анализи за вродени наследствени признаци са обект на строги разпоредби в тази страна, за които разпоредбите на Австрийския закон за генетичното инженерство (GTG) са определящи (определяне на съществуваща болест съгласно §65 GTG). В резултат този анализ може да бъде извършен от медицинската лаборатория само след писмено потвърждение от лицето, което трябва да бъде изследвано, законния настойник (в случай на непълнолетни, които не са в състояние да вземат решение) или законния представител (в случай на лица на възраст, които не са в състояние да вземат решение) относно изчерпателната информация, предоставена от лекуващият лекар трябва да се извърши по отношение на този генетичен тест (раздел 69 GTG).

Освен това пациентите обикновено имат право да забранят извършването на генетични тестове върху себе си.

За не-човешки генетични PCR лабораторни анализи обаче се прилагат много по-малко строги разпоредби. Най-вече това се отнася до лабораторни методи от областта на диагностиката на инфекцията.

По отношение на референтните стойности на тези лабораторни методи трябва да се прави разлика между качествени и количествени методи:

Качествените PCR методи обикновено дават „положителен“или „отрицателен“резултат, като „отрицателен“обикновено е референтната стойност

С количествения метод на PCR, в зависимост от метода, се определят подходящи прагови стойности (така наречените "гранични стойности"), от кога резултатът трябва да бъде оценен като патологичен.

Препоръчано: